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HIGH FIDELITY DNA POLYMERASEN

BESTELL-INFORMATION

PFU DNA POLYMERASE (2.5 U/µl)

Best.-Nr.

Units

10x pfu Reaktionspuffer
5x Band Doctor

Preis (EUR)

# PF 100
100 0.5 ml 0.25 ml     

49,00

# PF 500
500

2.4 ml

1.2 ml     
200,00

LONG HIGH FIDELITY PCR ENZYM MIX (2.5 U/µl)

Best.-Nr.

Units

10x HF Reaktionspuffer 5x Band Doctor

Preis (EUR)

# HF 100
100 0.5 ml 0.25 ml     

49,00

# HF 500
500
2.4 ml 1.2 ml     
200,00


BESCHREIBUNG

Die pfu DNA Polymerase ist eine hochgereinigte, rekombinante, thermostabile DNA Polymerase. Sie wird aus E. coli isoliert, dass den Vektor für das DNA Polymerase Gen aus Pyrococcus furiosus trägt. Das Enzym ist 25-fach genauer als die Taq DNA Polymerase und produziert blunt-end Amplifikate.

Der Long High Fidelity PCR Enzym Mix ist ein Gemisch aus DNA Polymerasen. Die Zusammensetzung ist speziell so gewählt, dass hochpräzise und effiziente Amplifikationen von Fragmenten bis zu 30 kb mit hohem GC-Anteil oder anderen schwierigen Strukturen möglich sind.

Unit Definition

Ein Unit ist die Enzymmenge, die benötigt wird, um 10 nmol dNTP in 30 min bei 72°C in eine Polynukleotid-Fraktion (adsorbiert an DE-81) einzubauen.

Lagerungspuffer pfu Polymerase

50 mM Tris/HCl (pH 8.0 bei 25°C), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% (v/v) Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 0.1% (v/v) Tween 20, 50% (v/v) Glycerol.

Lagerungspuffer HF Polymerase

20 mM Tris/HCl (pH 8.0 bei 25°C), 100 mM KCL, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% (v/v) Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 0.1% (v/v) Tween 20, 50% (v/v) Glycerol.

10x Reaktionspuffer

500 mM Tris/HCl, 140 mM (NH4)2SO4, 17.5 mM MgCl2, (pH 9.1 bei 25°C).

Endonuklease Assay

Keine Umwandlung von kovalent geschlossener zirkulärer DNA in genickte DNA nachweisbar. (Reaktionsbedingungen: Inkubation von 15 units pfu/High Fidelity DNA Polymerase mit 0.5 µg pUC-19-plasmid-DNA in 10 µl 1x Reaktionspuffer mit 1.5 mM MgCl2 für 2 h bei 72°C).

Exonuklease Assay

Kein Abbau (smearing) von Fragmenten nachweisbar. (Reaktionsbedingungen: Inkubation von 5 units pfu/High Fidelity DNA Polymerase mit 0.5 µg pUC-19-plasmid-DNA (Verdau mit Hpa II) in 10 µl 1x Reaktionspuffer mit 1.5 mM MgCl2 für 2 h bei 72°C).

Ribonuklease Assay

Kein Abbau der 28S/18S Banden nachweisbar. (Reaktionsbedingungen: Inkubation von 5 units pfu/High Fidelity DNA Polymerase mit 1 µg Gesamt-RNA (aus Rattenleber) in 10 µl 1x Reaktionspuffer mit 1.5 mM MgCl2 für 2 h bei 72°C).

Funktioneller Assay

Die pfu DNA Polymerase und die High Fidelity DNA Polymerase wurden mit der Amplifikation eines 20 kb Fragmentes humaner genomischer DNA getestet.


BASIS PROTOKOLL

Komponente

Volumen (in µL)

10x pfu/HF Reaktionspuffer

5

10 mM dNTP-Mastermix

1

Vorwärts-Primer (10 pmol/µl)

2

Rückwärts-Primer (10 pmol/µl)

2

Template-DNA

variabel

5x Band Doctor

0 – 20

pfu/HF Polymerase (2.5 U/µl)

0.5

2x destilliertes, steriles Wasser

Zugabe auf Endvolumen von 50

Endvolumen

50


CYCLING PROGRAMM

Schritt

Temperatur (in °C)

Dauer

Zyklen

Enzym Aktivierung

95

2 min

1

Denaturierung

95

20 sec

10 – 40

Annealing

AT *

40 sec

10 – 40

Extension

72

Siehe Kapitel E (Anwendung)

10 – 40

Finale Extension

72

5 min

1

AT* : Annealing Temperature; Wählen sie die niedrigere Tm der beiden Primer;

AT = Tm5°C ; Tm = 2°C x (A+T) + 4°C x (G+C)


ANWENDUNG

A. Template

Template DNA

DNA Menge

Anzahl der Zyklen

Tierische genomische DNA

50 – 200 ng   

25 – 35

10 – 50 ng   

30 – 40

Bakterielle genomische DNA

10 – 50 ng   

20 – 25

1 – 5 ng   

30 – 35

Plasmid und Lambda DNA

1 – 5 ng   

20 – 30

B. DNA Polymerase

Für die Amplifikation langer Fragmente tierischer genomischer DNA sollte die Enzymmenge auf 2 oder 2.5 U erhöht werden.

C. 5x Band Doctor

Die Verwendung des Band Doctor ist optional. Bei der Amplifikation von DNA mit hohem GC-Anteil und komplexen Strukturen empfehlen wir eine finale Konzentration von 0.5x – 2x.

Komponente

Volumen (in µl)

Mix 1

Mix 2

Mix 3

Mix 4

Mix 5

10x pfu/HF Reaktionspuffer

5

5

5

5

5

10 mM dNTP-Mastermix

1

1

1

1

1

Vorwärts-Primer (10 pmol/µl)

2

2

2

2

2

Rüchwärts-Primer (10 pmol/µl)

2

2

2

2

2

Template-DNA

x

x

x

x

x

5x Band Doctor

0

5

10

15

20

pfu/HF Polymerase (2.5 U/µl)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

2x destilliertes, steriles Wasser

auf 50

auf 50

auf 50

auf 50

auf 50

D. 5x Primer Design

Die Primer können entweder manuell oder mit einer “Primer Design Software” hergestellt werden. Wir empfehlen einen Tm der hergestellten Primer von über 64°C und eine Annealing-Temperatur von über 58°C.

E. Extensionszeit

 

Die Extensionszeit sollte bei dem pfu DNA Polymerase 2 min/kb dauern. Bei der High Fidelity Polymerase sollte die Extensionszeit für kurze Fragmenten 30 sec/kb und bei Fragmenten über 5 kb 1 min/kb dauern.

Bei der Amplifikation von Fragmenten mit mehr als 5 kb sollte eine Extensions-Temperatur von 68°C gewählt werden.

LAGERUNG

Lagerung beo -20°C für 24 Monate.