GREEN DYE MASTER MIX/PROBE QPCR MASTER MIX

BESTELL-INFORMATION

2x GREEN DYE MASTER MIX (HOT START)

Best.-Nr.	Anzahl der 50 µl Reaktionen	Volumen	ROX (5 µM)	Flourescein (500 nM)	Preis (EUR)
# S 50	50	1.25 ml	250 µl	100 µl	59,50
# S 200	200	4 x 1.25 ml	1000 µl	400 µl	185,50
# S 400	400	8 x 1.25 ml	2000 µl	800 µl	352,00
# S 2000	2000	50 ml	10 000 µl	4000 µl	1520,00

Bitte geben Sie auf der Bestellung die Art des Referenz-Farbstoffes an: ROX oder Fluorescein.

2x PROBE QPCR MASTER MIX (HOT START)

Best.-Nr.	Anzahl der 50 µl Reaktionen	Volumen	ROX (5 µM)	Flourescein (500 nM)	Preis (EUR)
# P 50	50	1.25 ml	250 µl	100 µl	51,50
# P 200	200	4 x 1.25 ml	1000 µl	400 µl	161,50
# P 400	400	8 x 1.25 ml	2000 µl	800 µl	306,00
# P 2000	2000	50 ml	10 000 µl	4000 µl	1322,00

Bitte geben Sie auf der Bestellung die Art des Referenz-Farbstoffes an: ROX oder Fluorescein.

BESCHREIBUNG

Der 2x Green DYE Master Mix und der 2x Probe qPCR Master Mix beinhalten alle benötigten Reagenzien für eine Real Time PCR, so dass die PCR leicht und einfach durchzuführen ist.

Die Konzentrationen aller Bestandteile (einschließlich der Hot Start Taq DNA Polymerase) sind optimal für eine erfolgreiche PCR aufeinander abgestimmt. Mit dem 2x Green DYE Master Mix müssen Sie nur noch die entsprechenden Primer und die Template-DNA, beim 2x Probe qPCR Master Mix zusätzlich noch die Probes, zufügen, so dass der Pipettieraufwand und auch der Eintrag möglicher Fehlerquellen minimiert wird. Der Referenz-Farbstoff ROX oder Fluorescein ist in einem separaten Röhrchen beigefügt.

Der Green DYE Master Mix und der 2x Probe qPCR Master Mix ermöglichen den universellen Nachweis eines jeden PCR Produktes und können somit für jede kommerziell erhältliche Real Time PCR Anlage verwendet werden.

Die hoch spezifische und hoch sensitive Hot Start Polymerase, sowie die hoch gereinigten dNTP’s führen zu exzellenten Ergebnissen bei der PCR Effizienz, den Korrelationskoeffizienten und der Steigung.

Effizienz der Amplifikation von humanem GAPDH mittels einer logarithmisch seriellen Verdünnung von 1 ng bis 1 pg auf dem RG-3000 (Corbett Research).

SCHMELZKURVE

Für Amplifikate die in der Real Time PCR mit Green DYE detektiert werden, ist es wichtig nach der Amplifikation eine Schmelzkurve aufzunehmen. Dies ist notwendig, da Green DYE in jegliche Art doppelsträngiger DNA interkaliert und somit ebenfalls Primer-Dimere, DNA Verunreinigungen und PCR Produkte von falsch angelagerten Primern nachweist.

Der Schmelzpunkt (T_m) des Amplifikates korreliert mit dem Maximum der Ableitung des Schmelzkurven-Profiles.

Ableitung der Schmelzkurve von Standardkurven auf der Real Time Anlage, endogene GAPDH Kontrolle. Die Kurve zeigt deutlich, dass das Maximum (Schmelzpunkt des Amplifikates) bei 81.5°C liegt. Die Graphik zeigt weiterhin, daß keine Verunreinigungen durch andere Produkte bei der PCR aufgetreten sind. Wären Verunreinigungen durch DNA oder oder Primer-Dimere vorhanden gewesen, wären neben dem erwarteten Amplifikat-Peak weitere Peaks an anderer Stelle aufgetreten.

BASIS PROTOKOLL FÜR 2x GREEN DYE MASTER MIX

Komponente	Volumen (in µl)	Finale Konzentration
2x Master Mix	25	1x
Primer Mix	15	300 nM*
Template-DNA	10	100 – 300 nM

* Die Primerkonzentration im Ansatz sollte 300 nM nicht überschreiten. Höhere Konzentrationen führen zu unspezifischen Amplifikationen und nicht zu mehr Produkt. Die empfohlene Schmelz-Temperatur der Primer liegt bei 53 – 60°C.

Die empfohlene Schmelz-Temperatur der Primer liegt bei 60°C.

CYCLING PROGRAMM FÜR 2x GREEN DYE MASTER MIX

Schritt	Temperatur (in °C)	Dauer	Zyklen
Enzym Aktivierung	95	15 min	1
Denaturierung	94	15 sec	45
Annealing	60	30 sec	45
Extension	72	30 sec	45

CYCLING PROGRAMM FÜR 2x PROBE QPCR MASTER MIX

Schritt	Temperatur (in °C)	Dauer	Zyklen
Enzym Aktivierung	95	10 min	1
Denaturierung	95	15 sec	50
Annealing	60	30 sec	50
Extension	72	30 sec	50

QUALITÄTSKONTROLLE

FUNKTIONELLE TESTS	SPEZIFIKATION
Quantitative PCR
Steigung	-3.0 > Steigung > -3.6
Korrelationskoeffzient	> 0.990
Effizienz	110% > Effizienz > 90%
PHYSIKALISCHE TESTS	SPEZIFIKATION
DNA Assay	Keine Kontamination nachweisbar
Endonuclease Assay	Keine Aktivität
DNase Assay	Keine Aktivität
RNase Assay	Keine Aktivität

TROUBLE SHOOTING

Beobachtung	Check
Vorbereitung des Reaktionsansatzes	Mischen Sie alle Komponenten vor der Verwendung vorsichtig, um Konzentrations-gradienten im Röhrchen zu vermeiden. Kein Vortexen, keine Zentrifugation! Bewahren Sie den Master Mix bis zur Verwendung lichtgeschützt auf. Minimieren Sie Einfrier- und Auftauzyklen durch das Aliquotieren des Master Mixes. Setzen Sie das Reaktionsgemisch auf Eis an. Pipettieren Sie zuerst den Primer-Mix, dann das Template und zuletzt den Master Mix.
Verhinderung von Kontaminationen	Reinigen Sie die Arbeitsfläche und das Equipment regelmäßig mit 3%iger Wasserstoffperoxid-Lösung. Tragen Sie bei den Arbeiten einen Laborkittel und Handschuhe. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn Sie vermuten, dass sie kontaminiert sind. Verwenden Sie separate Bereiche und fest zugeordnete Geräte für die Probenvorbereitung, das PCR Setup, die PCR Amplifikation und die Analyse der PCR Produkte. Verhindern Sie, dass amplifizierte PCR Produkte in den Arbeitsbereich für das PCR Setup kommen. Lassen Sie die Reaktionsansätze und die einzelnen Komponenten so wenig wie möglich unverschlossen. Verwenden Sie eine Verdränger-Pipette oder Aerosol-resistente Pipettenspitzen.
Geringe Korrelation	Führen Sie die Reaktionen als Dreifach-Bestimmung durch.
Wahl der Verbrauchsmaterialien	Benutzen Sie ausschließlich hochwertige, optisch klare Platten und Abdeckungen, die speziell für die Anwendung zur Floureszensmessung konzipiert sind.
Vorbereitung der Platten	Benutzen Sie nicht die Vertiefungen in den Ecken. Führen Sie immer Positivkontrollen (Kontroll-DNA) und Negativkontrollen (Wasser oder Puffer) mit.