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PFU MASTER MIX / LONG RANGE PCR MASTER MIX

BESTELL-INFORMATION

HIGH FIDELITY PCR, 2x PFU MASTER MIX (pfu DNA Polymerase, 2.5 U/µl)

Best.-Nr.

Anzahl der 50 µl Reaktionen

Volumen
5x Band Doctor

Preis (EUR)

# R 550 100 2 x 1.25 ml 0.25 ml     

89,50

# R 551
500

10 x 1.25 ml

1.2 ml     
375,00

2x LONG RANGE PCR MASTER MIX (High Fidelity PCR Enzyme Mix, 2.5 U/µl)

Best.-Nr.

Anzahl der 50 µl Reaktionen

Volumen
5x Band Doctor

Preis (EUR)

# R 560 100 2 x 1.25 ml 0.25 ml     

89,50

# R 561
500

10 x 1.25 ml

1.2 ml     
375,00


BESCHREIBUNG

Der 2x PCR Master Mix beinhaltet alle benötigten Reagenzien für eine Real Time PCR, so dass die PCR leicht und einfach durchzuführen ist. Die Konzentrationen aller Bestandteile (einschließlich pfu DNA Polymerase und des High Fidelity PCR Enzym Mix) sind optimal für eine erfolgreiche PCR aufeinander abgestimmt. Mit dem 2x PCR Master Mix müssen Sie nur noch die entsprechenden Primer und die Template-DNA zufügen, wodurch der Pipettieraufwand und auch der Eintrag möglicher Fehlerquellen minimiert wird.

Der 2x pfu Master Mix ist für die PCR Amplifikation von DNA-Fragmenten von bis zu 4 kb geeignet. Der 2x Long Range PCR Master Mix ist konzipiert für die Amplifikation von DNA-Fragmenten bis zu 30 kb, aber auch längere Targets können in den meisten Fällen erfolgreich amplifiziert werden.


QUALITÄTSKONTROLLE

FUNKTIONELLE TESTS

SPEZIFIKATION

4 kb (High Fidelity PCR)

Amplifikation erfolgreich

30 kb (Long and Accurate PCR)

Amplifikation erfolgreich

PHYSIKALISCHE TESTS

SPEZIFIKATION

Endonuklease Assay

Keine Aktivität nachweisbar

DNase Assay

Keine Aktivität nachweisbar

RNase Assay

Keine Aktivität nachweisbar


BASIS PROTOKOLL

Pipettieren Sie die folgenden Komponenten auf Eis in ein PCR-Reaktionsgefäß und geben Sie die entsprechende Menge Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 50 µl zu erreichen:

Komponente

Volumen (in µl)

Mix 1

Mix 2

Mix 3

Mix 4

Mix 5

2x PCR Master Mix

25

25

25

25

25

Template DNA

x

x

x

x

x

Primer (10 µM, jeweils)

2

2

2

2

2

5x Band Doctor

0

5

10

15

20

2x dest., steriles Wasser

auf 50

auf 50

auf 50

auf 50

auf 50

Mischen Sie alle Komponenten vor der Verwendung vorsichtig, um Konzentrationsgradienten im Röhrchen zu vermeiden. Kein Vortexen oder Zentrifugieren. Die optimalen Konzentrationen der Primer, der Templates sowie das Temperaturprofil im Cycler müssen für jede Reaktion individuell angepasst werden.


CYCLING PROGRAMM FÜR 4 kb PCR ASSAY

Schritt

Temperatur (in °C)

Dauer

Zyklen

Enzym Aktivierung

95

2 min

1

Denaturierung

95

20 sec

10 – 40

Annealing

AT*

40 sec

10 – 40

Extension

72

2 min/kb

10 – 40

Finale Extension

72

5 min

1

CYCLING PROGRAMM FÜR 30 kb PCR ASSAY

Schritt

Temperatur (in °C)

Dauer

Zyklen

Enzym Aktivierung

95

2 min

1

Denaturierung

95

20 sec

10 – 40

Annealing

AT*

40 sec

10 – 40

Extension

72

30 sec/kb

10 – 40

Finale Extension

72

5 min

1

AT* : Annealing Temperature; Wählen sie die niedrigere Tm der beiden Primer;

AT = Tm – 5°C ; Tm = 2°C x (A+T) + 4°C x (G+C)


ANWENDUNG

A. Template

Template DNA

DNA Menge

Anzahl der Zyklen

Tierische genomische DNA

50 – 200 ng   

25 – 35

10 – 50 ng   

30 – 40

Bakterielle genomische DNA

10 – 50 ng   

20 – 25

1 – 5 ng   

30 – 35

Plasmid und Lambda DNA

1 – 5 ng   

20 – 30

B. 5x Band Doctor

Die Verwendung des Band Doctor ist optional. Bei der Amplifikation von DNA mit hohem GC-Anteil und komplexen Strukturen empfehlen wir eine finale Konzentration von 0.5x – 2x.

C. 5x Primer Design

Die Primer können entweder manuell oder mit einer “Primer Design Software” hergestellt werden. Wir empfehlen einen Tm der hergestellten Primer von über 64°C und eine Annealing-Temperatur von über 58°C.

D. Extensionszeit

Die Extensionszeit sollte bei dem pfu Master Mix 2 min/kb dauern. Bei dem Long Range PCR Master Mix sollte die Extensionszeit für kurze Fragmenten 30 sec/kb und bei Fragmenten über 5 kb 1 min/kb dauern.

Bei der Amplifikation von Fragmenten mit mehr als 5 kb sollte eine Extensions-Temperatur von 68°C gewählt werden.


LAGERUNG

Lagerung bei -20°C für 12 Monate.